PCR ELECTROSPRAY IONIZATION – MASS ELECTROSPRAY
By. Ahmad Mawardi, M.Sc.
Mukaddimah Penulis
1. Introduction
Metode ini memiliki keunggulan pada beberapa aspek yaitu :
Saya akan mencoba menguraikan bagaimana alat ini dapat bekerja. Berdasarkan workflow chart diatas dapat dijelaskan bahwa salah satu contoh sampel yang diperoleh dari darah pasien (sampel bisa darimana saja) kemudian dilakukan pre-ekstraksi yaitu mempersiapkan reagen yang dibutuhkan. Setelah itu dilakukan ekstraksi dan purifikasi DNA dan dilanjutkan dengan proses amplifikasi menggunakan PCR. PCR biasanya dilakukan sebanyak 30-40 siklus, namun terlebih dahulu kita set primer sesuai dengan diagnosis awal yang dilakukan. Jika si pasien terindikasi menderita penyakit yang disebabkan oleh bakteri maka disiapkan multiplex pairs of broad-range primers yang dirancang dapat mendeteksi bagian RNA ribosom 16S dan 23S dari jenis bakteri patogen. namun apabila tidak diketahui penyebabnya maka digunakan primer multiplex yang dapat menyisir virus, bakteri dan parasit sekaligus dalam satu kali running. Para ahli genetika sudah berhasil memetakan gen pada berbagai makhluk hidup yang ada di dunia termasuk mikrobia patogen sehingga sudah diketahui area area tertentu (conserve region) yang menjadi penanda suatu spesies.
Setelah Proses PCR selesai, Gen target terampifikasi. Tahap selanjutnya yaitu desalting sebagai proses pemurnian amplikon. Hal ini menunjukkan bahwa kerja alat sangat sensitif dan spesifik sehingga diperlukan proses desalting menghilangkan sisa reagen yang terbawa setelah selesai proses PCR. Barulah setelah prosess desalting, amplikon akan menuju alat biospray, disemprot sehingga partikel DNA tersebut memasuki ruang kapiler yang sangat sempit, kemudian amplikon akan mengalami fragmentasi yaitu proses terpisahnya untaian ganda (DNA double strand) menjadi single strand. Setelah itu secara bersamaan satu per satu single strand amplikon tersebut diberikan muatan berupa ion ion (Ionized DNA process) Lihat Gambar dibawah ini.
Tentunya proses deconvolution ini membutuhan software khusus yang dirancang oleh perusahaan terkait, namun hal tersebut menjadikan tingkat keakuratan 99,9% untuk identifikasi spesies. Dengan mencocokkan jumlah basa A,G,T,C sampel kemudian dicocokkan dengan database maka jenis spesiesnya dapat kita ketahui.
Demikkian pembahasan mengenai PCR ESI-MS. Lain waktu nanti akan kita bicarakan mengenai "rival"nya yaitu PCR MALDI-TOF. Saya sangat menyadari akan kekurangan dari ilmu yang saya miliki, Wallahu A’lam, benar atau salahnya mohon di koreksi bersama. Semoga tulisan ini dapat membantu.
By. Ahmad Mawardi, M.Sc.
Pada Tulisan kali ini saya akan menjelaskan mengenai suatu produk yang sedang nge-hits di dunia per-PCR-an, suatu terobosan dalam mendeteksi berbagai macam mikrobia patogen menggunakan metode dan teknologi terkini. Teknologi tersebut menggabungan tiga kelompok alat yang saling bekerja secara simultan sehingga menghasilkan analisa yang 99,9% akurat. Salah satu alat yang menjadi inisiator dalam mengembangkan teknologi ini berasal dari Amerika yaitu PLEX-ID system dibawah korporasi Abbot Corp. Berikut saya jelaskan mengenai manfaat dari alat ini, jenis instrumen yang dipakai dan bagaimana langkah kerjanya dalam mendeteksi suatu sampel. Adapun tujuan dari penulisan ini adalah menyebarkan informasi mengenai perkembangan alat deteksi terkini dikarenakan sedikitnya literatur yang berbahasa indonesia. Materi ini saya sampaikan dalam sebuah presentasi di salah satu perusahaan di Jakarta Pusat. Semoga tulisan ini bermanfaat. Baca juga teknologi PCR/ESI MS
1. Introduction
PCR/ESI-MS seperti yang sudah saya jelaskan sebelumnya di blog bagian 1 bahwa Teknologi ini bekerja saling terintegrasi antara instrumen yang satu dengan yang lainnya bertujuan untuk deteksi suatu sampel sampai pada level strain. Teknologi ini dapat digunakan pada berbagai macam bidang ilmu terutama di Bidang Kedokteran (Klinis). Seringkali pasien datang di Rumah Sakit dengan penyakit baru yang dideritanya namun penyebab penyakit tersebut belum dikenal apakah disebabkan oleh bakteri, parasit, jamur ataupun virus, maka teknologi ini dapat digunakan sebagai satu cara cepat, efektif dan akurat untuk mendeteksi penyakit baru tersebut. Informasi hasil uji DNA menggunakan teknologi ini, dapat digunakan oleh dokter dalam memberikan tindakan kepada pasien secara tepat dan cepat. Teknologi ini dapat pula mengetahui adanya resistensi dari suatu obat yang telah diterapi ke pasien.
 |
| Cakupan kemanfaatan PCR ESI-MS |
Selain di bidang kedokteran, teknologi ini dapat digunakan untuk mendeteksi adanya ancaman dari senjata biologi yang digunakan oleh pihak pihak tertentu untuk tujuan yang jahat (Biodefence). Misalkan beberapa waktu yang lalu kita mendapatkan berita ada warga China yang menanam cabai berbakteri yang sampai sekarang belum diketahui penanggulangannya atau ada kasus pengiriman amplop kosong di kedutaan Australia yang diduga terdapat virus didalamnya. Oleh sebab itu penting adanya dengan teknologi ini, perlu deteksi dini dari ancaman biothreat. Beberapa jenis biothreat yang menjadi ancaman yaitu sesuai tabel 1.
 |
| kelompok mikrobia yang digunakan sebagai senjata biologi |
Tidak hanya di bidang kedokteran maupun biodefence, namun dapat digunakan untuk keperluan research, bidang bioteknologi molekular, analisa bakteri patogen pada makanan untuk industri dan terutama pada analisa patogen untuk eksport perikanan.
a. Dapat mendeteksi lebih dari 10.000 jenis mikroorganisme patogen
Kelompok mikrobia patogen terdiri dari golongan bakteri, virus, parasit dan fungi. Jumlanya akan terus bertambah seiring dengan munculnya varian varian baru, kita semua tahu bahwa bakteri misalnya sangat cepat beradaptasi, bermutasi bertujuan melindungi dirinya sehingga memungkinkan terjadinya perubahan genetik yang menghasilan varian baru, bisa jadi lebih berbahaya dari varian sebelumnya.
b.Identifikasi spesifik
Teknologi ini tidak hanya deteksi pada level genus, tetapi sampai level terspesifik yaitu jenis spesies dan variannya. Adapun rincian jumlah strain yang dideteksi menggunakan alat ini secara keseluruhan berjumlah 14.923 spesies dan 62.198 strain dan hal ini akan terus bertambah seiring dengan perkembangan teknologi dan mutasi mikroorganisme tersebut.
Kelompok mikrobia patogen terdiri dari golongan bakteri, virus, parasit dan fungi. Jumlanya akan terus bertambah seiring dengan munculnya varian varian baru, kita semua tahu bahwa bakteri misalnya sangat cepat beradaptasi, bermutasi bertujuan melindungi dirinya sehingga memungkinkan terjadinya perubahan genetik yang menghasilan varian baru, bisa jadi lebih berbahaya dari varian sebelumnya.
b.Identifikasi spesifik
Teknologi ini tidak hanya deteksi pada level genus, tetapi sampai level terspesifik yaitu jenis spesies dan variannya. Adapun rincian jumlah strain yang dideteksi menggunakan alat ini secara keseluruhan berjumlah 14.923 spesies dan 62.198 strain dan hal ini akan terus bertambah seiring dengan perkembangan teknologi dan mutasi mikroorganisme tersebut.
c. Sampel dapat diperoleh dari berbagai sumber.
Sampel dapat kita ambil atau peroleh dari berbagai macam sumber. Ada 5 klasifikasinya yaitu sampel yang di isolasi dari lingkungan contohnya dari udara, dari swab permukaan dan sampel air. Sampel yang berasal dari bahan biologis contohnya adalah kultur bakteri atau kultur virus. Sampel Klinikal contohnya dari darah, swab lendir kerongkongan, swab bagian mulut, sputum (air liur) dan kulit. Untuk sampel makanan seperti daging, susu dan bahan produksi. Untuk Forensik contohnya diambil dari rambut, tulang, darah dan gigi.
d. Proses deteksi yang sangat cepat dan akurat
Dalam sekali running, alat ini dapat mendeteksi 96 sampel sekaligus dan hanya membutuhkan waktu 6 jam/running. Itu artinya dapat mendeteksi 384 sampel selama seharian penuh (24 jam).
e. Multiple Sample
Maksudnya adalah dalam sekali running, alat ini dapat mendeteksi berbagai macam sampel yang berasal daril lintas genus dan spesies. Kita dapat mendeteksi bakteri, virus, parasit atau fungi secara bersamaan. Selain itu, dalam satu sampel, kita dapat mengecek beberapa jenis mikrobia sekaligus. Hal ini disebabkan oleh adanya desain multiple primer dan pemanfaatan teknologi yang kekinian.
2. Instrumen
Instrumen yang digunakan dalam mendeteksi suatu sampel terbagi menjadi 3 kelompok yaitu :
a. Ekstraksi dan Purifikasi DNA
Pada proses ini dilakukan ekstraksi DNA yaitu melisiskan segala macam bahan penyusun sel selain DNA sekaligus memurnikannya (purifikasi), saya masih ingat pada saat di Laboratorium KJT UGM, saat mengekstrak DNA kalus Anggrek secara manual membutuhkan berbagai macam reagen, tahapan dan proses yang cukup panjang dan waktu yang relatif lama, dimulai dari melisiskan dinding sel, menghilangkan komponen penyusun sel, pengendapan sampai dengan pemanenan. Namun kali ini prosesnya dilakukan secara otomatis. Cukup menggunakan regen yang sudah diracik terdiri dari lisys buffer, elution buffer dan washing buffer maka semua partikel penyusun sel seperti lipid, karbohidrat dan protein akan larut. Alatnya berupa beat beater, Plate Setup dan Sample prep. Khusus untuk sampel jamur dan tumbuhan yang memiliki dinding sel tentuya harus dilakukan teknik penghilangan dinding sel dengan cara fisik, salah satunya menggunakan nitrogen cair.
b. Amplifikasi
Pada kelompok ini terdapat dua alat yaitu PCR Thermal cycler dan PCR Setup. PCR Thermal cycle memuat fase fase Denaturasi, Annealing dan Elongation. Proses ini bertujuan untuk memperbanyak DNA target. Dapat dipastikan bahwa DNA target ini diperoleh dengan bantuan primer Reverse dan primer Forward, reagen berupa dNTP, Taq Polimerase, Buffer, Pure Water, MgCl2 dan dye fluoresence. Tidak hanya DNA, RNA pun dapat kita amplifikasi namun harus melewati dua tahap yaitu RNA dibuat cDNA dengan bantuan enzim reverse transkriptase. Apabila sudah terbentuk cDNA maka akan dilanjutkan ke proses denaturasi dan seterusnya. Keberhasilan amplifikasi dapat dilihat dari nilai Ct yang tampil, postif jika grafik menunjukkan fase eksponensial pada nilai Ct kurang dari 35. Nilai Ct juga dapat digunakan untuk mengetahui jumlah amplikon yang berhasil di amplifikasi. DNA target Hasil amplifikasi ini dinamakan dengan amplikon.
c. Identifikasi dengan mengetahui komposisi basa
Kelompok ini terdiri dari 3 macam alat yang dirangkai menjadi satu komponen yang bekerja secara simultan. Adapun bagiannya yaitu komponen desalting, Electrospray Ionization Mass Spectrometer dan Organism Identification computerize. Ionisasi amplikon dilakukan agar memudahkan menghitung jumlah basa berupa Adenin (A), Guanin (G), Timin (T) dan Citocyn (C). Keempat macam basa nitrogen ini dihitung satu persatu secara sistem (mass analyzer) sehingga jika jumlah basa (base count) diketahui maka akan mudah dicocokkan dengan database. Database memuat data komposisi basa dari masing masing patogen tersebut dikarenakan prinsipnya bahwa jumlah basa A,G,T,C setiap mikrobia patogen berbedabeda.
3. Pinsip Kerja
Sampel dapat kita ambil atau peroleh dari berbagai macam sumber. Ada 5 klasifikasinya yaitu sampel yang di isolasi dari lingkungan contohnya dari udara, dari swab permukaan dan sampel air. Sampel yang berasal dari bahan biologis contohnya adalah kultur bakteri atau kultur virus. Sampel Klinikal contohnya dari darah, swab lendir kerongkongan, swab bagian mulut, sputum (air liur) dan kulit. Untuk sampel makanan seperti daging, susu dan bahan produksi. Untuk Forensik contohnya diambil dari rambut, tulang, darah dan gigi.
d. Proses deteksi yang sangat cepat dan akurat
Dalam sekali running, alat ini dapat mendeteksi 96 sampel sekaligus dan hanya membutuhkan waktu 6 jam/running. Itu artinya dapat mendeteksi 384 sampel selama seharian penuh (24 jam).
e. Multiple Sample
Maksudnya adalah dalam sekali running, alat ini dapat mendeteksi berbagai macam sampel yang berasal daril lintas genus dan spesies. Kita dapat mendeteksi bakteri, virus, parasit atau fungi secara bersamaan. Selain itu, dalam satu sampel, kita dapat mengecek beberapa jenis mikrobia sekaligus. Hal ini disebabkan oleh adanya desain multiple primer dan pemanfaatan teknologi yang kekinian.
2. Instrumen
Instrumen yang digunakan dalam mendeteksi suatu sampel terbagi menjadi 3 kelompok yaitu :
a. Ekstraksi dan Purifikasi DNA
Pada proses ini dilakukan ekstraksi DNA yaitu melisiskan segala macam bahan penyusun sel selain DNA sekaligus memurnikannya (purifikasi), saya masih ingat pada saat di Laboratorium KJT UGM, saat mengekstrak DNA kalus Anggrek secara manual membutuhkan berbagai macam reagen, tahapan dan proses yang cukup panjang dan waktu yang relatif lama, dimulai dari melisiskan dinding sel, menghilangkan komponen penyusun sel, pengendapan sampai dengan pemanenan. Namun kali ini prosesnya dilakukan secara otomatis. Cukup menggunakan regen yang sudah diracik terdiri dari lisys buffer, elution buffer dan washing buffer maka semua partikel penyusun sel seperti lipid, karbohidrat dan protein akan larut. Alatnya berupa beat beater, Plate Setup dan Sample prep. Khusus untuk sampel jamur dan tumbuhan yang memiliki dinding sel tentuya harus dilakukan teknik penghilangan dinding sel dengan cara fisik, salah satunya menggunakan nitrogen cair.
b. Amplifikasi
Pada kelompok ini terdapat dua alat yaitu PCR Thermal cycler dan PCR Setup. PCR Thermal cycle memuat fase fase Denaturasi, Annealing dan Elongation. Proses ini bertujuan untuk memperbanyak DNA target. Dapat dipastikan bahwa DNA target ini diperoleh dengan bantuan primer Reverse dan primer Forward, reagen berupa dNTP, Taq Polimerase, Buffer, Pure Water, MgCl2 dan dye fluoresence. Tidak hanya DNA, RNA pun dapat kita amplifikasi namun harus melewati dua tahap yaitu RNA dibuat cDNA dengan bantuan enzim reverse transkriptase. Apabila sudah terbentuk cDNA maka akan dilanjutkan ke proses denaturasi dan seterusnya. Keberhasilan amplifikasi dapat dilihat dari nilai Ct yang tampil, postif jika grafik menunjukkan fase eksponensial pada nilai Ct kurang dari 35. Nilai Ct juga dapat digunakan untuk mengetahui jumlah amplikon yang berhasil di amplifikasi. DNA target Hasil amplifikasi ini dinamakan dengan amplikon.
c. Identifikasi dengan mengetahui komposisi basa
Kelompok ini terdiri dari 3 macam alat yang dirangkai menjadi satu komponen yang bekerja secara simultan. Adapun bagiannya yaitu komponen desalting, Electrospray Ionization Mass Spectrometer dan Organism Identification computerize. Ionisasi amplikon dilakukan agar memudahkan menghitung jumlah basa berupa Adenin (A), Guanin (G), Timin (T) dan Citocyn (C). Keempat macam basa nitrogen ini dihitung satu persatu secara sistem (mass analyzer) sehingga jika jumlah basa (base count) diketahui maka akan mudah dicocokkan dengan database. Database memuat data komposisi basa dari masing masing patogen tersebut dikarenakan prinsipnya bahwa jumlah basa A,G,T,C setiap mikrobia patogen berbedabeda.
3. Pinsip Kerja
 |
| Alur langkah kerja deteksi PCR ESI-MS |
Setelah Proses PCR selesai, Gen target terampifikasi. Tahap selanjutnya yaitu desalting sebagai proses pemurnian amplikon. Hal ini menunjukkan bahwa kerja alat sangat sensitif dan spesifik sehingga diperlukan proses desalting menghilangkan sisa reagen yang terbawa setelah selesai proses PCR. Barulah setelah prosess desalting, amplikon akan menuju alat biospray, disemprot sehingga partikel DNA tersebut memasuki ruang kapiler yang sangat sempit, kemudian amplikon akan mengalami fragmentasi yaitu proses terpisahnya untaian ganda (DNA double strand) menjadi single strand. Setelah itu secara bersamaan satu per satu single strand amplikon tersebut diberikan muatan berupa ion ion (Ionized DNA process) Lihat Gambar dibawah ini.
 |
| Proses spray - fragmentasi dan ionisasi |
Setelah proses ionisasi, selanjutnya dideteksi oleh detektor. Molekul dengan berat molekul yang sama akan jatuh pada tempat yang sama sehingga menghasilkan spektrum (mass spectrum), spektrum akan dibaca oleh komputer dalam bentuk peak. Semakin variatif molekul dengan berat yang berbeda maka akan menghasilkan banyak peak . Setiap peak yang muncul dapat kita hitung jumlah basa nitrogennya (A,G,T,C) dengan cara perhitungan otomatis (mass calculation) yang dilakukan oleh sistem. Hal ini disebut dengan Deconvolution.
 |
| Proses deconvolution sehingga menghasilkan angka angka (jumlah basa nitrogen) |
 |
| beberapa peak yang muncul menandakan hasil deteksi spesies yang berbeda |
Contoh peak yang muncul sesuai gambar dapat menunjukkan nama spesies. Seperti gambar diatas menunjukkan bahwa peak yang berbeda menunjukkan jenis spesies yang berbeda. Semakin tinggi puncak peaknya menunjukkan S. aureus dalam sampel jumlahnya lebih banyak. S.aureus memiliki jumlah A30 G29 C30 T29, K. pneumoniae memiliki jumlah A26 G32 C28 T30 dan E.coli memiliki jumlah A27 G33C 27 T29. Masing masing spesies menunjukkan perbedaan jumlah basa AGTC.
Secara ringkas dapat saya jelaskan berdasarkan gambar dibawah ini :
Secara ringkas dapat saya jelaskan berdasarkan gambar dibawah ini :
 |
| Ringkasan langkah kerja alat PCR ESI-MS |
Tahap pertama pada sistem ini yaitu proses ekstraksi dan purifikasi DNA sampel
Tahap kedua yaitu amplifikasi DNA target menggunakan primer R dan primer F, dapat berupa multiplex primers atau multiplex pairs of broad-range primers tergantung kebutuhan kita mencari mikrobia patogen berupa bakteri, virus, atau parasit.
Tahap ketiga yaitu Proses ionisasi DNA dengan terlebih dahulu dilakukan penyemprotan amplikon oleh alat biospray, kemudian dilakukan fragmentasi menjadi single strand DNA dan secara bersamaan dilakukan ionisasi. Proses ini dinamakan dengan electrospray ionization process.
Tahap keempat yaitu analisa molekul DNA (mass molecular) menggunakan mass analyzer dengan cara mendeteksi molekul ber-ion tersebut menggunakan detektor sehingga nanti akan memunculkan spektrum (mass spectrum). Masing masing peak dalam spektrum tersebut dapat menunjukkan spesies dengan cara dilakukan deconvolution penghitungan secara komputerisasi, mengkonversi antara berat molekul (weigh mass) dan jumlah molekul yang dideteksi. Proses deconvolution ini akan menampakkan jumlah masing masing basa (base composition) A,G,T,C.
Tahap terakhir yaitu mencocokkan jumlah A,G,T,C sampel yang diperoleh dengan database sehingga nanti akan muncul nama patogennya.
Daftar Pustaka
Tahap kedua yaitu amplifikasi DNA target menggunakan primer R dan primer F, dapat berupa multiplex primers atau multiplex pairs of broad-range primers tergantung kebutuhan kita mencari mikrobia patogen berupa bakteri, virus, atau parasit.
Tahap ketiga yaitu Proses ionisasi DNA dengan terlebih dahulu dilakukan penyemprotan amplikon oleh alat biospray, kemudian dilakukan fragmentasi menjadi single strand DNA dan secara bersamaan dilakukan ionisasi. Proses ini dinamakan dengan electrospray ionization process.
Tahap keempat yaitu analisa molekul DNA (mass molecular) menggunakan mass analyzer dengan cara mendeteksi molekul ber-ion tersebut menggunakan detektor sehingga nanti akan memunculkan spektrum (mass spectrum). Masing masing peak dalam spektrum tersebut dapat menunjukkan spesies dengan cara dilakukan deconvolution penghitungan secara komputerisasi, mengkonversi antara berat molekul (weigh mass) dan jumlah molekul yang dideteksi. Proses deconvolution ini akan menampakkan jumlah masing masing basa (base composition) A,G,T,C.
Tahap terakhir yaitu mencocokkan jumlah A,G,T,C sampel yang diperoleh dengan database sehingga nanti akan muncul nama patogennya.
Daftar Pustaka
- Robert O’hara et al, 2013, Evaluation of PCR electro-spray ionization-mass spectrometry (PCR/ESI-MS) Fungal Spectrum Assay, The leeds Teaching hospital
- Daniela Jacob, et al, 2012. Rapid and High-Throughput Detection of Highly Pathogenic Bacteria by Ibis PLEX-ID Technology, PLoSONE : Volume 7, Issue 6
- Cassandra L. Brinkman, et al., 2013. PCR-Electrospray Ionization Mass Spectrometry for Direct Detection Of Pathogens and Antimicrobial Resistance from Heart Valvesin Patients with Infective Endocarditis, Journal of Clinical Microbiology p.2040–2046 Volume 51 No. 7
- Tim Brooks, Carrie Turner & Jackie Duggan, 2013, Presentation : The Abbott Plex-ID and RIPL, Rare & Imported Pathogens Laboratory, PHE Porton Down, Public Health England
- Mike McDermott , 2011. PLEX-ID Technology Overview/Assay Descriptions, Oklahoma State Dept Health Public Health Laboratory, Annual Meeting State Enviromental Laboratory Conference
- Harpin Vannesa, 2012. Next Generation Molecular Testing: PCR/ESI-MS. Abbott Molecular
Demikkian pembahasan mengenai PCR ESI-MS. Lain waktu nanti akan kita bicarakan mengenai "rival"nya yaitu PCR MALDI-TOF. Saya sangat menyadari akan kekurangan dari ilmu yang saya miliki, Wallahu A’lam, benar atau salahnya mohon di koreksi bersama. Semoga tulisan ini dapat membantu.
Comments
Post a Comment