Perkembangan terbaru metode deteksi mikroorganisme
PCR/ESI-MS
Polimerase Chain Reaction Electrospray Ionization Mass Spectrometer
oleh : Ahmad Mawardi, M.Sc.
diambil dari jurnal. referensi terlampir.
Selama
lebih dari 20 tahun terakhir ini, dalam hal deteksi mikroorganisme kita kenal
dengan metode konvensional PCR, multiplex PCR, Real Time PCR dan multiplex Real
Time PCR. Sekarang ini perkembangannya mencapai titik yang terbaik yaitu dengan
adanya PCR Electrospray Ionization Mass Spectrometri yang dapat
mengidentifikasi semua jenis patogen pada manusia dari berbagai jenis isolasi
bakteri ataupun secara langsung dari spesimen secara klinis. Pengujian dengan pengembangan
primer merupakan suatu strategi terbaik untuk deteksi secara keseluruhan
kategori patogen yaitu dari bakteri, mikobakteri, fungi, parasit ataupun virus.
Dengan proses amplifikasi yang dilanjutkan dengan deteksi komposisi basa nitrogen dalam suatu
nukleotida, metode ini dapat menentukan jenis patogen hingga level genus,
spesies dan strain. Dengan menggunakan
PCR-ESI MS ini merupakan metode yang pertama kali berhasil mendeteksi virus
H1N1 di Amerika.
Sejarah dari PCR ESI MS
Karena lambatnya proses deteksi dan identifikasi
bakteri atau virus yang biasanya digunakan sebagai senjata biologi, maka Ibis
Teknologi menginisiasi mengembangkan suatu alat sebagai bentuk pertahanan dari
serangan senjata biologi (biothreath) sekaligus dapat digunakan pada kegiatan
klinis. Adapun strategi yang harus dilakukan berkaitan dengan penanganan
serangan patogen haruslah dapat mencakup 3 hal yaitu proses identifikasi yang
sangat cepat, Epidemi suatu patogen dapat diawasi dan segala penyebaran
penyakit dapat ditelusuri atau yang kita kenal dengan istilah triangulasi
identifikasi evaluasi untuk ancaman terkait dengan bahaya genetik.
Prinsip Kerja PCR ESI MS
1. Sample Preparation (Proses persiapan sampel)
Langkah awal yaitu seperti halnya pengujian
menggunakan PCR konvensional atau RT PCR, DNA sampel harus diekstraksi terlebih dahulu, baik
sampel dari pengambilan langsung kepada spesimen atau dari hasil kultur maupun
isolasi. Proses ekstraksi ini dapat dilakukan secara manual dan menggunakan
alat ekstraksi otomatis. Sampel dapat diperoleh
dari berbagai macam sumber seperti :
a. sampel yang di isolasi dari
lingkungan contohnya dari udara, dari swab
permukaan dan air.
b. Sampel yang
berasal dari biologis contohnya adalah kultur bakteri atau kultur virus.
c. Sampel Klinis contohnya dari swab lendir kerongkongan, mulut, sputum (air liur) dan kulit.
d. sampel makanan seperti daging, susu dan bahan produksi pangan lainnya.
e. Sampel Forensik
contohnya diambil dari rambut, tulang, darah dan gigi.
2. Multiplex PCR atau RT PCR
Setelah melalui tahap Ekstraksi, DNA dimasukkan kedalam well
mikrotiter plate untuk di amplifikasi. Setiap well ini mengandung satu pasang
atau banyak primer target spesifik (tergantung pengujian). panjang primer
berkisar antara 15-20 pasang basa sedangkan panjang DNA target yaitu berkisar
80-150 pasang basa tergantung jenis mikroorganismenya.
Untuk deteksi bakteri, kita ketahui bersama
bahwa DNA bakteri memiliki area coding
RNA, non coding DNA, protein encoding Gene, dan Ribosomal RNA sehingga
area gen tersebut yang bisa kita desain primernya untuk dijadikan area deteksi.
3. Desalting
Setelah
proses Amplifikasi, Amplikon mengalami proses desalting sebelum diinjeksi
kedalam mass spektrometer, fungsinya yaitu untuk menganalisis adanya muatan
molekul negatif.
4. Electrospray Ionization Mass Spectrometer
Ada atau tidaknya Ion
Negatif suatu molekul sangat penting dalam metode deteksi khusus alat ini, dikarenakan ion tersebut digunakan untuk anlisis. Pada proses Elektrospray Ionisasi akan men-charger amplikon hasil running PCR dengan ion
negatif kemudian dialirkan ke mass
spectrometri untuk dilakukan pendeteksian ion negatif yang ada pada molekul
oligonukleotida amplikon. Secara pengertian, Mass Spectrometry adalah suatu teknik analisis yang
sensitif, menghitung jumlah
massa molekul/pengisian ion (m/z) . Untuk mengoptimalisasi proses ini sistem ESI akan
memisahkan ikatan double stranded DNA menjadi single stranded yaitu memisahkan ikatan hidrogen antara pasangan
basa menjadi satu untai DNA target. Pemisahan strand DNA target tersebut
berdasarkan rasio massa per charge (pengisian ion negatif). Molekul dengan
berat molekul yang rendah dan jumlah ion yang sedikit akan berjalan terlebih dahulu menuju detektor dibandingkan molekul yang
lebih berat dengan jumlah ion yang banyak. Banyaknya jumlah massa yang sama akan
membentuk peak dan banyaknya peak yang berbeda yang muncul disebut
dengan mass spectrum.
Hasil dari mass spectrum disebut deconvoluted, suatu proses
yang mana dapat dilihat menggunakan perhitungan matematis yang sederhana.
Jumlah amplikon yang utuh dikalkulasi. Setelah jumlah amplikon diketahui, software Alogaritma akan meprediksikan komposisi basa dari strand tersebut. Perhitungan
tersebut didasarkan pada perhitungan jumla Adenin, Guanin, Sitosin dan Tymin suatu molekul. Hal ini dimungkinkan untuk
mendeteksi berbagai macam mikroorganisme diakrenakan sampai hari ini susunan
gen sebagian besar dari mikroorganisme berhasil di petakan.
Referensi :
Donna M. Wolk, Erin J. Kaleta, Vicki H. Wysocki, 2012. Review : PCR–Electrospray Ionization Mass Spectrometry The Potential to Change Infectious Disease Diagnostics in Clinical and Public Health Laboratories. The Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 14, No.4.
Comments
Post a Comment