PCR/ESI-MS Polimerase Chain Reaction Electrospray Ionization Mass Spectrometer 1

Perkembangan terbaru metode deteksi mikroorganisme

PCR/ESI-MS Polimerase Chain Reaction Electrospray Ionization Mass Spectrometer

oleh : Ahmad Mawardi, M.Sc.

diambil dari  jurnal. referensi  terlampir.

Proses PCR ESI-MS

         Selama lebih dari 20 tahun terakhir ini, dalam hal deteksi mikroorganisme kita kenal dengan metode konvensional PCR, multiplex PCR, Real Time PCR dan multiplex Real Time PCR. Sekarang ini perkembangannya mencapai titik yang terbaik yaitu dengan adanya PCR Electrospray Ionization Mass Spectrometri yang dapat mengidentifikasi semua jenis patogen pada manusia dari berbagai jenis isolasi bakteri ataupun secara langsung dari spesimen secara klinis. Pengujian dengan pengembangan primer merupakan suatu strategi terbaik untuk deteksi secara keseluruhan kategori patogen yaitu dari bakteri, mikobakteri, fungi, parasit ataupun virus. Dengan proses amplifikasi yang dilanjutkan dengan deteksi  komposisi basa nitrogen dalam suatu nukleotida, metode ini dapat menentukan jenis patogen hingga level genus, spesies dan strain.  Dengan menggunakan PCR-ESI MS ini merupakan metode yang pertama kali berhasil mendeteksi virus H1N1 di Amerika.

Sejarah dari PCR ESI MS

       Karena lambatnya proses deteksi dan identifikasi bakteri atau virus yang biasanya digunakan sebagai senjata biologi, maka Ibis Teknologi menginisiasi mengembangkan suatu alat sebagai bentuk pertahanan dari serangan senjata biologi (biothreath) sekaligus dapat digunakan pada kegiatan klinis. Adapun strategi yang harus dilakukan berkaitan dengan penanganan serangan patogen haruslah dapat mencakup 3 hal yaitu proses identifikasi yang sangat cepat, Epidemi suatu patogen dapat diawasi dan segala penyebaran penyakit dapat ditelusuri atau yang kita kenal dengan istilah triangulasi identifikasi evaluasi untuk ancaman terkait dengan bahaya genetik.

Prinsip Kerja PCR ESI MS

1.  Sample Preparation (Proses persiapan sampel)

      Langkah awal yaitu seperti halnya pengujian menggunakan PCR konvensional atau RT PCR, DNA sampel harus diekstraksi terlebih dahulu, baik sampel dari pengambilan langsung kepada spesimen atau dari hasil kultur maupun isolasi. Proses ekstraksi ini dapat dilakukan secara manual dan menggunakan alat ekstraksi otomatis. Sampel dapat diperoleh  dari berbagai macam sumber seperti :

  a. sampel yang di isolasi dari lingkungan contohnya dari udara, dari swab permukaan dan air. 

  b. Sampel  yang berasal dari biologis contohnya adalah kultur bakteri atau kultur virus. 

  c.  Sampel Klinis contohnya dari swab lendir kerongkongan, mulut, sputum (air liur) dan  kulit. 

  d. sampel makanan seperti daging, susu dan bahan produksi pangan lainnya. 

  e. Sampel Forensik contohnya diambil dari rambut, tulang, darah dan gigi.

2. Multiplex PCR atau RT PCR

        Setelah melalui tahap Ekstraksi, DNA dimasukkan kedalam well mikrotiter plate untuk di amplifikasi. Setiap well ini mengandung satu pasang atau banyak primer target spesifik (tergantung pengujian). panjang primer berkisar antara 15-20 pasang basa sedangkan panjang DNA target yaitu berkisar 80-150 pasang basa tergantung jenis mikroorganismenya. Untuk deteksi bakteri, kita ketahui bersama bahwa DNA bakteri memiliki area coding RNA, non coding DNA, protein encoding Gene, dan Ribosomal RNA sehingga area gen tersebut yang bisa kita desain primernya untuk dijadikan area deteksi.

3. Desalting

       Setelah proses Amplifikasi, Amplikon mengalami proses desalting sebelum diinjeksi kedalam mass spektrometer, fungsinya yaitu untuk menganalisis adanya muatan molekul negatif.

 

4. Electrospray Ionization Mass Spectrometer

         Ada atau  tidaknya Ion Negatif suatu molekul sangat penting dalam metode deteksi  khusus alat ini, dikarenakan ion tersebut digunakan untuk anlisis. Pada proses Elektrospray Ionisasi akan men-charger amplikon hasil running PCR dengan ion negatif kemudian dialirkan ke mass spectrometri untuk dilakukan pendeteksian ion negatif yang ada pada molekul oligonukleotida amplikon. Secara pengertian, Mass Spectrometry adalah suatu teknik analisis yang sensitif, menghitung  jumlah massa molekul/pengisian ion (m/z) . Untuk mengoptimalisasi proses ini sistem ESI akan memisahkan ikatan double stranded DNA menjadi single stranded yaitu  memisahkan ikatan hidrogen antara pasangan basa menjadi satu untai DNA target. Pemisahan strand DNA target tersebut berdasarkan rasio massa per charge (pengisian ion negatif). Molekul dengan berat molekul yang rendah dan jumlah ion yang sedikit akan berjalan terlebih  dahulu menuju detektor dibandingkan molekul yang lebih berat dengan jumlah ion yang banyak. Banyaknya jumlah massa yang sama akan membentuk peak dan banyaknya peak yang berbeda yang muncul disebut dengan mass spectrum.

      Hasil dari mass spectrum disebut deconvoluted, suatu proses yang mana dapat dilihat menggunakan perhitungan matematis yang sederhana. Jumlah amplikon yang utuh dikalkulasi. Setelah jumlah amplikon diketahui, software Alogaritma akan meprediksikan komposisi basa dari strand tersebut. Perhitungan tersebut didasarkan pada perhitungan jumla Adenin, Guanin, Sitosin dan Tymin suatu molekul. Hal ini dimungkinkan untuk mendeteksi berbagai macam mikroorganisme diakrenakan sampai hari ini susunan gen sebagian besar dari mikroorganisme berhasil di petakan.

Referensi :

Donna M. Wolk, Erin J. Kaleta, Vicki  H. Wysocki, 2012. Review : PCR–Electrospray Ionization Mass Spectrometry The Potential to Change Infectious Disease Diagnostics in Clinical and Public Health Laboratories. The Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 14, No.4.